近日，国际权威期刊《Nature Communications》在线发表了新澳网门票官方网站新澳网门票官方网站瞿旭东教授与澳大利亚昆士兰大学贾新颖博士及Bostjan Kobe教授的合作成果“Molecular Basis of Regio- and Stereo-Specificity in Biosynthesis of Bacterial Heterodimeric Diketopiperazines”，该工作是瞿旭东教授课题组在吡咯并吲哚骨架生物合成领域取得的又一重要突破。瞿旭东教授、昆士兰大学贾新颖博士和Bostjan Kobe教授为论文的共同通讯作者，新澳网门票官方网站新澳网门票官方网站博士后孙成海和昆士兰大学博士后罗震遥为本文的共同第一作者。

细菌来源的异源二聚化吡咯并吲哚类生物碱是一类复杂且生物活性多样的重要的天然产物。由于该类生物碱核心结构中有两个连续的叔碳和季碳手性中心，使得化学合成极具难度，目前尚未有统一高效的化学合成方法实现该类生物碱的高效快速合成及结构拓展。为解决这一瓶颈问题，瞿旭东教授课题组另辟蹊径，采用生物学方法在该类生物碱的生物合成领域取得了一系列成果。

此前，在研究海洋链霉菌Streptomyces sp. CMB-MQ030来源的异源二聚化产物NAS-C的生物合成过程中，瞿旭东教授团队发现了关键P450酶NascB，通过自由基介导的串联反应，NascB可催化两分子的含色氨酸的环二肽（cW-X）以不同方式进行异源二聚，同时该酶具有非常广泛的底物谱，通过喂养化学合成的20种cW-Xs，成功创造出了30种具有不同区域/立体选择性的异源二聚化产物。相关研究同样已发表在《Nature Communications》上（2018, 9, 4428. DOI: 10.1038/s41467-018-06528-z）。

在NascB这一关键P450被发现后，国外一些研究团队进行了多项基因组挖掘研究，相继又发现了多个不同P450酶，其可分别催化环二肽底物产生五种具有不同区域/立体选择性的异源二聚化产物；而解决这些发现背后的更深层次的科学问题，即P450酶如何调控反应过程中的区域/立体选择性，则是本项目的研究目标。

该项研究首先通过基因组挖掘及蛋白功能鉴定发掘三个与NascB高度同源的三个P450酶（NasbB，Nas_S1868 and Nas_F5053），其中Nas_S1868 可催化产生异源二聚化产物ASP-A，而Nas_F5053可以同时产生ASP-A, NAS-B和NAS-C。比对NascB、Nas_S1868 和 Nas_F5053的氨基酸序列发现，Nas_F5053的前112个氨基酸与NascB完全一致，Nas_F5053剩余的后半段与Nas_S1868几乎完全一致，说明Nas_F5053前112个氨基酸中存在调控NAS-C生成的关键位点，而其后半段存在调控生成ASP-A的关键位点，为此通过一系列的嵌段突变及单点突变研究，成功发现四个氨基酸位点Q65, A86及S284, V288对环二肽底物的异源二聚化方式存在重要调控作用；突变体Nas_F5053-Q65I+A86G只产生NAS-C，而Nas_F5053- S284A+V288A只产生NAS-C。同时，通过对这四个位点进行饱和突变研究，Nas_F5053- A86K+V288P突变体可催化cW-P底物产生新的异源二聚化产物NAS-E，进一步证实这四个关键氨基酸位点控制了反应的区域和立体选择性。

为深入理解Nas_F5053催化过程中的分子基础，本项目昆士兰大学合作方解析了Nas_F5053，Nas_F5053-Q65I+A86G及Nas_F5053- S284A+V288A的底物复合物晶体结构，发现三者的活性口袋中均有两分子的底物cW-P，其中一分子底物处于弯曲状态，有利于生成吡咯并吲哚稠环核心骨架，并进攻另一分子处于相对舒展状态的底物生成最终产物，但仅通过这些晶体结构并不能解释为什么Nas_F5053能够产生不同的产物。为此，本研究进一步采用分子动力学模拟的方法，通过比对Nas_F5053与Nas_F5053-Q65I+A86G、Nas_F5053- S284A+V288A及Nas_F5053- A86K+V288P的动力学结果，发现Q65-A86两个位点突变后，αB’-αC Loop发生位移，使得弯曲底物的N10和C2之间距离变大，难以生成NAS-C；而S284-V288两个位点突变后，舒展底物周围的空间变大，舒展底物移向heme活性中心，导致其对弯曲底物的束缚能力降低，弯曲底物移向αI螺旋，刚性随之变强，N10和C2之间距离变小，只能生成NAS-C。此外，通过统计比对C2-C3-C12-N10形成的二面角，发现Nas_F5053- S284A+V288A中二面角主要为负值，利于生成NAS-C构型；而Nas_F5053- A86K+V288P中为正值，利于NAS-E的生成。晶体结构学和分子动力学结合，清晰地解释了P450酶在催化环二肽底物二聚过程中的调控机制。

这项工作系统深入的解析了细菌P450催化环二肽底物区域/立体选择性二聚的分子基础，为后期酶工程改造及实现吡咯并吲哚类生物碱的高效快速合成奠定了坚实基础。

该项目的研究工作受到了国家自然科学基金，上海市超级博士后项目以及国家重点研发项目的支持。

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